撰文 | 石悦琳
责编 | 丁霄哲
审稿 | 陈欣泓
编者按
Molecular Instruments是一家脱胎于加州理工学院分子技术中心的初创企业。公司的核心技术是一种名为HCR的核酸原位杂交链式反应技术，这种技术使用两种可以自聚合的荧光探针将细胞中原本微弱的单个核酸分子的荧光信号线性放大，被应用在生物医学研究的各个领域。科考夫团队实地采访了这家位于洛杉矶市的公司，与创始人Harry Choi聊了聊Molecular Instruments的过去现在和未来，谈了谈他和团队创办公司的心路历程。
四面通透的落地窗，洛杉矶早晨的远山和飞鸟，百米开外熙攘的Eagle Rock大街，眼前的一切让人很难相信这是一家生物技术公司，直到一张张敦实的木制实验台，庞然的实验仪器，和头顶爬满的巨大银色管道慢慢进入视线。这是科考夫与生物初创企业Molecular Instruments创始人Dr. Harry Choi的一次访谈，也是科考夫团队的第一次实地采访。
Molecular Instruments公司实景1杂交链式反应(HCR)技术
要了解Molecular Instruments这家公司，就不得不提一项名为杂交链式反应 (Hybridization Chain Reaction, HCR) 的革新技术。
几乎所有生物研究都面临的一个问题，就是如何检测到细胞深处微弱的信息，它可能是一次DNA的转录，一次蛋白质的结合，或是一次微管的瓦解……通常我们需要借助某种作为中介的“生物传感器“来特异性识别/结合靶标并将信号转导放大，而不同类型的“传感器”往往通过非常不同的机理起作用。以生物专业的同学们熟知的聚合酶链式反应（PCR）为例，它通过使用两段与目标DNA序列互补的单链DNA作为“引物”，通过耐高温的聚合酶在温度循环驱动下对目标DNA进行指数级的复制，从而完成信号的放大。
然而，PCR依赖于高温和成分复杂的反应体系，使得它只能在体外的试管中进行，这个过程就导致了DNA分子位置信息的丢失。生物学家们更希望能通过某种方法在组织中原位地读取各个细胞内的信息，以维持原本的空间关系和足够的信息精细度。
传统原位杂交方法的诞生正是为了解决保留空间位置信息的难题。其中一种最简单的方法叫做荧光原位杂交 (Fluorescent insitu hybridization, FISH)。杂交过程利用的同样是DNA双链互补配对原则，和PCR中的“引物”用法类似，设计跟需要检测的DNA互补的单链DNA作为“探针”，并给这些单链DNA安上荧光基团。这样通过简单的一次杂交就可以把用荧光把目标分子标记上。
然而，不同于PCR中可以进一步将信号指数级放大，传统原位杂交的信号强度就止步于单个荧光基团了，因此单个RNA分子上的荧光强度很低，使用传统的光学显微镜观测达不到单分子的分辨率。所以传统的原位杂交方法虽然维持了空间关系，但精度却差强人意。
直到1998年，在原位杂交技术被提出近30年后，科学家们才首次实现了对单细胞内单个RNA分子的原位检测，并由此掀起了单分子荧光原位杂交技术（smFISH）的热潮。[1]
单RNA分子成像检测技术
图片来源：参考文献 [2]
不同于传统原位杂交技术，smFISH会使用多达50个寡核苷酸探针来标记同一个RNA分子（图2A），这一方面放大了单分子上的信号强度，另一方面，由于多个寡核苷酸探针同时结合到非目标物上的概率极低，多探针标记极大提升了信噪比，使得在普通荧光显微镜下检测单分子RNA成为了可能。
在此之后，多种smFISH的改进版本被提出[2]，人们发现相比于费力地为一个RNA分子设计50多个探针，引入次级探针来放大信号是一种更简单灵活的方法。
具体来说，主探针不再带有荧光标记，它们只负责与靶标RNA特异性结合；而每个主探针末尾都被加上了一段公共序列（称为readout）用来结合次级荧光标记物（图2B）或结合可搭载多个次级荧光标记物的载体（称为amplifier），最后通过次级荧光标记物的积累来完成信号的放大（图2C,D）。首个转录组水平的单细胞成像使用的就是其中一种称为bDNA的技术，实现了人类细胞928个mRNA分子的原位检测。[3]
这些类似bDNA的技术到现在仍然实用，但它们略显繁琐的操作步骤却阻碍了其大规模的使用，有没有什么方法能让探针信号在体内自发放大呢？
2010年，一种基于完全不同原理的smFISH方法横空出世，巧妙地解决了这个难题。（图2E）这一技术的核心原理就是杂交连锁反应（HCR），这是一种不需任何外部温度或酶的触发即可自动放大核酸底物信号的的方法，它依赖的是触发DNA纳米结构的自组装这一热力学过程。[4]
杂交链式反应示意图
向两种发夹（h1, h2）的稳定混合物中添加DNA的引发链（i1），从而触发发夹之间的杂交链式反应。
HCR早在2004年就已经被加州理工学院Niles Pierce教授实验室提出。HCR的原理十分简单：供HCR自发发生的能量来源于储存在两种精心设计的“核酸发夹”中的势能。这些发夹在没有外物触发的时候通常十分稳定，两种发夹即使混合在一起也会相安无事，但如果向发夹混合物中加入一小段单链DNA引发剂，整个平衡就会立刻被打破，单链DNA会迫使其中一种发夹打开，使其暴露出一个新的单链区域，这又会打开另一种发夹，暴露出与第一段引发剂相同的单链区域。（图1）由此，一个个发卡就像一块块倒下的多米诺骨牌，加入核苷酸双链的延伸，一直生长直到发夹供应耗尽。
虽然HCR的初衷并不是为了服务于原位杂交技术，但当时还是Niles Pierce实验室一名博士生的Harry Choi很快想到，将这一原理稍加改造利用就能应用于单分子原位杂交，这一新技术将会大大缩短已有方法的实验周期和成像效率。这个名为In situ HCR技术的大胆想法也就成为了MolecularInstruments公司的起点。2对话创始人Harry Choi
问:可以具体介绍一下公司的主要产品和技术吗?
我们目前的主要产品是基于HCR技术（见上文）的多通道定量生物成像产品。当时在Pierce lab我们已经证明了HCR反应本身的可靠性，可以通过可控的核酸自组装来实现信号的定量放大。这种对反应环境的极低要求让我们想到也许可以利用这项技术来在体内定量放大组织中的原位RNA、DNA或蛋白质。
我们的思路是，首先将HCR引发剂与需要的DNA探针相连，用来与目标RNA特异性结合；其次将两种发夹都标记上荧光分子，这样，在DNA探针找到目标之后，向组织引入发夹混合物，HCR反应就会自动开启，并将放大的信号以荧光的形式呈现出来。[5]
Insitu HCR图示（第三代）
图片来源：https://www.molecularinstruments.com
因为HCR反应的能量来自于发夹分子中的势能，整个过程不需要控温或者酶体系等，操作非常简单快捷。更重要的是，由于HCR所使用的DNA探针和发夹分子都只有数十碱基对长，可以轻松穿透若干毫米厚的组织，在穿透性上也要优于其他原位杂交技术。我们目前已经成型的第三代产品，通过将引发链改为二聚体的形式，还极大降低了背景噪声。[6]
这套系统也可以很容易地实现多通道检测。目前，在Molecular Instrument, 已经有至少10套互不干扰的发夹对可供同时使用。在HCR的操作过程中，限速步骤主要是第一步的探针结合阶段，所以即使后续加上多轮的冲洗、重新显色，也可以在很短时间内完成。
美丽的Molecular Instrument Gallery
图片来源：https://www.molecularinstruments.com
问:目前HCR技术主要应用在哪些地方？
所有需要用到原位RNA成像的地方都可以使用我们的技术。这其中就包括像药物研发、临床诊断或者其它有大规模转录分析需求的公司和企业。当然，更多的还是来自基础科研的需求。
问: 为什么决定创办Molecular Instruments？可以简单讲讲你个人的经历以及公司建立的过程吗？
我本科就读于加州大学伯克利分校，不过一开始我学的是土木工程方向。有一天偶然听到了一个生物工程的讲座，让我很受触动，之后就选修了一些生物方面的课程。那时候生物工程这个专业的界定还非常模糊，导致只上了几门生物课的我毕业的时候竟然拿到了生物工程的学位。
我博士期间来到了加州理工学院，当时Niles实验室几乎还全是以计算为主，我和几个同年级的学生可以说是一手搭建了实验室的“湿”实验系统。现在想来那段经历倒是为我现在创办公司打下了基础。
在Niles实验室做了几个小项目之后，我们拿到了In situ HCR的基金，虽然风险非常大，但我还是选择了这个项目。之后整整两年，我几乎每天都在漆黑的地下室看着显微镜里的一片虚无，那段日子现在还记忆犹新，好在最终成功了。第一版In situ HCR技术在2010年发表在了Nature Biotechnology上。
临近毕业的时候，挺不忍心就这样离开这个还在摇篮中的技术，当时学校里正好有好几个实验室表示想合作使用这项技术，我就选择留在加州理工建立起了一个名叫MolecularTechnologies的rescourse center，一方面可以继续完善技术，一方面也方便和其他实验室交流合作。
后来这个小小的rescourse center不断发展壮大，随着这项技术趋于成熟，我们收到了越来越多来自校外甚至国外的订单。当时仅仅时包裹邮寄都成为了一笔不小的开支，把这项服务商业化成为了最好的选择。这也时我创立MolecularInstruments的初衷。现在我们有专业的包装、客服，我希望可以让这项技术更好的服务科研工作者。
Molecular Instruments产品
问:从博士生到企业创始人，这其中的变化一定是天翻地覆的，这种角色转变是怎样一种体验呢？
角色转变确实非常大。我比较幸运的地方在于，运营加州理工rescourse center的那段经历算是帮我完成了过渡。在rescourse center的时候，我已经从一个研究者变成了半个服务者，我要学会理解合作者的需求并及时沟通解决各种问题，把握产品的改进方向等等。当然领导一个公司又是另外一番情景了，现在彻底离开了benchwork，日常大多是是marketing、与人商谈、公司运营等等方面的事情。每天都在学习很多新的领域新的知识，和博士期间按部就班的生活来比，节奏变快了非常多。
问:公司的未来发展方向大致会有哪些呢？
目前我们的RNA的相关产品已经非常成熟了。我们通过客户调查了解到他们未来最大的需求就是对蛋白质的检测，这也是我们现阶段研发的重点，理论上只需要将我们的引发剂连接在抗体上就可以实现对抗体信号的放大了。我们接下去可能还会增加对DNA的检测，形成一个可实现的DNA-RNA-蛋白质同时成像的“3D”系统。
问:创建公司的过程中哪些困难让你印象比较深刻？
最近感触挺深的一点其实是发现以前在学校里很多认为理所当然的事情都并不简单。比如说学校里遍地都有双纯水，我们却要购置一个大型的多段过滤设备，才能把洛杉矶的硬水变成实验用水，系统搭完还要把水样送给政府部门审核好几次；比如说现在才知道学校里的实验室紧急洗眼器原来挺贵的；还比如头顶这些通风管道，要做到符合生物实验室标准也并不简单，等等等等。
这不，正说着，房顶修理工就到了，在一阵叮当声中，科考夫结束了这次实地采访。
问：MolecularInstruments是一家很有前景的公司，刚才您聊到公司正有研发新方向的打算，想必非常需要新鲜力量的加入。可以在这里介绍一下公司目前需要哪些方面的人才吗？
当然可以。我们现在还是一个比较小的团队，我们欢迎任何对HCR成像技术感兴趣的科研人员加入。在研发方面，我们的近期目标首先是将HCR系统拓展到DNA和蛋白质的原位成像。我们还将开展与外部实验室的合作，在不同的生物体或组织中探索新的可能。我们希望应聘者能够独立主动高效地工作，富有责任心，并且乐于奉献，注重细节，做事有条理，善于沟通。想知道更多信息的读者可以参考我们在Indeed上公布的职位信息：
Research Associate –
https://www.indeed.com/job/research-associate-8083ea4ca4ba2a3b
Research Scientist –
https://www.indeed.com/job/research-scientist-c7051d36779f286a
参考文献：
[1] Femino, A.M., Fay, F.S., Fogarty, K., and Singer, R.H. (1998).
Visualization of single RNA transcripts in situ. Science280, 585–590.
[2]Pichon, X., Lagha, M., Mueller, F., & Bertrand, E. (2018). A GrowingToolbox to Image Gene Expression in Single Cells: Sensitive Approaches for Demanding Challenges. Molecular Cell, 71(3), 468–480.
[3] Battich, N., Stoeger, T., & Pelkmans, L.(2013). Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods, 10(11), 1127–1133.
[4]Dirks, R.M., & Pierce, N.A. (2004). Triggered amplification byhybridization chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 101(43), 15275–15278.
[5]Choi, H.M.T., Chang, J.Y., Trinh, L.A., Padilla, J.E., Fraser, S.E., &Pierce, N.A. (2010). Programmable in situ amplification for multiplexed imagingof mRNA expression.
NatBiotechnol, 28:1208–1212.
[6]Choi, H.M.T., Schwarzkopf, M., Fornace, M.E., Acharya, A., Artavanis, G.,Stegmaier, J., Cunha, A., & Pierce, N.A. (2018). Third-generation in situhybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile,robust. Development, 145, dev165753.
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